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本试剂盒是针对Western Blot检测实验研发的，同时也适用于Dot Blot实验，具有节约实验时间、检测灵敏度高、背景低和系统稳定等特点。使用该产品可在不减弱实验灵敏度的情况下，将封闭时间缩短至5min，并将一抗结合洗涤与二抗结合合并为一个步骤，将实验时间缩减到50min左右。胶上的蛋白转移到印迹膜上后经快速封闭，并使用一抗与抗体反应液及稀释液混合而成的抗体孵育液短时间孵育印迹膜后，再经简单洗涤即可进行化学发光或显色检测。本试剂盒适用于目的蛋白一抗来源为人、小鼠、兔、猪、猴等实验系统，可使用10次。

• 操作简单便捷，将常规间接法Western Blot所需的4~5h实验时间缩短至50min左右即可完成。
  
• 无需额外添加二抗，节约试剂成本。
  
• 背景低，可重复性好，与常规Western Blot具有相同的灵敏度。
  
• 适用于HRP系统发光或显色检测。

• 当一抗为单抗或经过抗原亲和纯化的高亲和力抗体时，可直接采用一步法实验步骤：
  
  • 以6×8cm膜为例，转膜完成后，将膜按正常的洗涤步骤用1X TBS或1X PBS洗涤2次，每次5min。
    
  • 洗膜的同时准备封闭液和抗体孵育液：取5mL封闭液A和5mL封闭液B在离心管内相混合，涡旋震荡形成均一的悬浊液，即为封闭液C；另取一支新的离心管，向其加入2.5μL抗体反应液HRP(通用Ⅰ)和人，小鼠，兔，猪，猴源等来源的一抗5～10μg混匀后静置5min左右，再加入10mL抗体稀释液中混匀，即为抗体孵育液。
    
    • 一抗的用量可根据抗体的稀释度来进行调整。以抗体的最终稀释度1:1000为例，可取2.5μL抗体反应液HRP(通用Ⅰ)和10μL一抗，静置后再加入到10mL抗体稀释液中混匀即可。
      
    • 混合后的封闭液C及抗体孵育液需现配现用，超过30min后不可以再使用。每次用量约为10mL，可根据膜面积的大小按比例进行调整。
      
    • 抗体反应液推荐使用量为2.5μL，如果所使用一抗量较大、效价低或者纯度不高时可适量加大抗体反应液用量，具体需根据预实验情况进行调整。如果膜面积较小，可按比例减少一抗，抗体反应液HRP(通用Ⅰ)及抗体稀释液的用量。
  • 在步骤1中，用1X TBS或1X PBS洗涤膜完成后，倒掉洗涤液，将膜放入盛有已混合好的封闭液C的容器中(确保封闭液完全浸没膜表面)，在摇床上以适当转速室温孵育5min左右(转速不要过于剧烈，以防膜破裂)。
    
  • 将膜从封闭液C中取出，浸于蒸馏水中，在摇床上以较大转速漂洗2次，每次1min(转速不要过于剧烈，以防膜破裂)。
    
  • 将混合后的抗体孵育液加到膜上(确保抗体孵育液完全浸没膜表面)，在摇床上以适当速度室温孵育40min左右(转速不要过于剧烈，以防膜破裂)。
    
  • 洗涤液准备：取5mL的10X洗涤液用蒸馏水稀释至50mL备用。
    
  • 弃去或回收抗体孵育液，先将膜放入蒸馏水中漂洗30sec，再用50mL的1X洗涤液漂洗3min，之后再用蒸馏水漂洗30sec。
    
  • 进行底物显影或显色，建议采用ECL发光试剂(GS1551/GS1440)或TMB显色试剂(GS1539)进行显色检测。
• 如果一抗为未经过抗原亲和纯化的多抗或抗血清时，则需采用以下步骤：
  
  • 以6×8cm膜为例，转膜完成后，将膜按正常的洗涤步骤用1X TBS或1X PBS洗涤2次，每次5min。
    
  • 洗膜的同时准备封闭液C：取5mL封闭液A和5mL封闭液B在离心管内相混合，涡旋震荡形成均一的悬浊液，即为封闭液C，可根据膜面积的大小进行调整。
    
  • 在步骤1中，用1X TBS或1X PBS洗涤膜完成后，倒掉洗涤液，将膜放入盛有封闭液C的容器中(确保封闭液完全浸没膜表面)，在摇床上以适当速度室温孵育5min左右(转速不要过于剧烈，以防膜破裂)。
    
  • 将膜从封闭液C中取出，浸于蒸馏水中，在摇床上以较大转速漂洗2次，每次1min(转速不要过于剧烈，以防膜破裂)。
    
  • 将10mL抗体稀释液和人，小鼠，兔，猪，猴源等来源一抗5～10μg混合形成一抗孵育液，将膜浸入到一抗孵育液中(确保完全浸没膜表面)，在摇床上以适当速度室温孵育30～40min左右(转速不要过于剧烈，以防膜破裂)。
    
    • 一抗的用量也可根据抗体的稀释度来进行调整。以抗体的最终稀释度1:1000为例，需要10μL一抗。如果膜面积较小，可按比例减少一抗，抗体稀释液的用量。
  • 弃去或回收一抗孵育液，用20mL蒸馏水洗膜2次，每次1min。
    
  • 取2.5μL的抗体反应液HRP(通用Ⅰ)加入到10mL抗体稀释液中或含有1%脱脂奶粉的1X TBST溶液(含0.05% Tween 20的TBS)中形成二抗孵育液，将膜浸入到二抗孵育液中，在摇床上以适当速度室温孵育30～40min左右(转速不要过于剧烈，以防膜破裂)。
    
  • 洗涤液准备：取5mL的10X洗涤液用蒸馏水稀释至50mL备用。
    
  • 弃去或回收二抗孵育液，先将膜放入蒸馏水中漂洗30sec，再用50mL的1X洗涤液漂洗3min，之后再用蒸馏水漂洗30sec。
    
  • 进行底物显影或显色，建议采用ECL发光试剂(GS1551/GS1440)或TMB显色试剂(GS1539)进行显色检测。

• 客户需要自备人、小鼠、兔、猪、猴等来源的一抗，一步法实验步骤要求一抗为单抗或经抗原亲和纯化的高亲和力抗体，如果一抗效价低或者为抗血清则须更多的优化实验或采用第二种实验步骤，同时，如果一抗的效价太低或使用的量太少或抗原的量太少，则需要将孵育时间延长到60～90min左右。
  
• 使用封闭液，抗体稀释液，洗涤液之前请充分混匀，同时封闭液与抗体稀释液需恢复到室温后再使用，以保证实验效果和实验结果的可重复性。
  
• 建议转膜完成后用丽春红染色液(GS1563)或超敏可逆印迹膜染色试剂盒I和II(GS1538，GS4356)对膜进行染色，以便将膜上多余部分剪去并增加试剂的使用效率。
  
• 一抗与抗体反应液HRP(通用Ⅰ)的最佳用量需要通过预实验来确定。
  
• 一抗、抗体反应液HRP(通用Ⅰ)和抗体稀释液的用量可根据膜的大小按比例增加或减少。
  
• 回收的抗体孵育液可以4℃保存，并在一周内使用，可重复使用3～4次，但可能会出现抗体浓度的改变或其他不利的变化，避免-20℃冻存。
  
• 如果存在较高背景和杂带的情况，请适当减少抗体的用量，并增加洗膜次数和时间。
  
• 本试剂盒不适用于磷酸化抗体检测磷酸化蛋白，也不能和生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为此时会产生较高的背景，一般情况下调整抗体的用量，增加洗膜次数和时间并不能够解决此问题。
  
• 本试剂盒同时适用于NC膜和PVDF膜，干燥的转印后NC膜在抗体孵育前，需要用蒸馏水浸泡5min，如果是PVDF膜则先用甲醇泡，再用水洗。实验效果还与膜的质量相关，请选择质优的NC膜或PVDF膜。
  
• 本制品也可以用于Dot Blot实验，实验过程与本试剂盒的操作步骤基本一致。
  
• 发光后的印迹膜经过一抗/二抗清除液(GS1567)或印迹膜再生液(GS1428、GS1545)处理后可以再次使用不同的抗体进行印迹发光。
  
• 除了注意事项8外，膜上出现的高背景或非特异性条带可以通过使用特异性好的一抗，减少一抗和抗体反应液的用量，增加洗涤时间，缩短显色或曝光的时间等方法进行优化。
  
• 产品中的保存条件及有效期均以未开封情况下计算，为了防止产品与空气接触发生化学反应影响产品性能，将未使用完毕的组分按存储要求保存同时建议开封后的组分尽快使用完毕。
  
• 本试剂只能够用于体外实验，不能够用于临床、治疗和动物体内实验等，由此产生的后果概不承担责任，同时使用后请旋紧瓶盖，防止溶液挥发和与空气中的物质发生化学反应。